()原生質體融合的影響因素

①融合劑 融合劑有化學融合劑和物理融合劑。

    現在普遍采用的化學融合手段是聚乙二醇(PEG)介導的化學融合法。PEG以分子橋的形式在相鄰原生質體膜間起中介作用．改變原生質膜的流動性能，降低原生質膜表面勢能，使膜中的蛋白顆粒凝集，形成一層易于融合的無蛋白質顆粒的磷脂雙分子層。在Ca 2+存在下，引起細胞膜表面的電子分布的改變，從而使接觸處的質膜形成局部融合．出現凹陷，形成原生質體橋，成為細胞間通道并逐漸擴大，直到兩個原生質體全部融合。PEG的分子量可分為幾種，適用的相對分子質量為000～6000，不同種類微生物對PEG分子量的要求不同。PEG的用量為30％～50％，但隨微生物種類不同而異。

    原生質體融合中常用的物理融合劑有電場和激光。電場融合的原理是利用電場的作用使原生質膜穿孔導致原生質體融合。電融合過程中電脈沖幅度、寬度、波數和個數等因素對質膜通透性變化都有較大影響。電融合頻率可比PEG法高十倍以上。激光融合是讓原生質體先粘在一起，再用高峰值功率密度激光對接觸處進行照射，使質膜被擊穿或產生微米級的微孔。激光融合的優點是毒性小、損傷小、定位強。

②無機離子PEG介導融合需要適量的Ca 2+ 、Mg 2+和一定的pH條件。在電場融合時．混合液中離子的存在對電場及原生質體偶極化形成偶極子有一定的影響，會干擾融合．因此，在電融合中一般采用糖或糖醇為穩定劑，盡量減少無機離子。

③溫度 溫度對原生質體融合頻率有一定的影響，一般在20～30 C下處理～0min。

④親株的親緣關系 雖然原生質體融合可以超越性障礙，但進行原生質體融合時是選擇親緣關系比較近的親株。因為遠緣親株融合時染色體交換后的重組體不穩定，易分離，會影響原生質體融合的效果。

⑤原生質體的活性 原生質體的活性對原生質體融合有很大的影響，因此要制備高活性的原生質體。

⑥細胞密度兩個親株進行原生質體融合時，需要一定的細胞密度．一般原生質體的濃度要達到07～08個／mL，這樣有助于提高融合頻率。

(2)融合體的再生 融合原生質體的再生包括融合體細胞壁和融合體的再生。細胞壁的重建只是原生質體再生過程中的一步，當完成原生質體再生后，進而發育形成菌落，整個過程稱為復原。復原不僅是指原生質體本身長出細胞壁，而且還能從原生質體細胞上長出有細胞壁的菌絲體。原生質體的復原是一個十分復雜的生物學過程，其中包括細胞本身的調節和修復。

(3)融合體檢出和鑒別方法

①直接法原生質體融合后直接分離到MM或SM上，即可直接檢出融合細胞。其優點是只需一步就可得到重組體，且大多數重組體是穩定的。缺點是難以檢出那些表型延遲而基因已重組的融合體。

②間接法把融合產物先分離到CM上，使原生質體再生．融合和非融合的原生質體都能生長，再分離到SM上。其優點是能促使細胞壁更好地再生．表型延遲重組體容易檢出。缺點是需要兩步才能檢出重組體，需要相當大人力和物力，而且得到的重組體不太穩定。

    直接法和間接法都要用營養缺陷型標記，所得重組體不一定能提高目標產物產量。

③鈍化選擇法鈍化選擇法是指滅活原生質體和具活性原生質體融合。把親本中的一方(野生型)原生質體在50℃熱處理2～3h，使融合前原生質體代謝途徑中的某些酶鈍化而不能再生．再與另一方(雙缺陷型)原生質體融合，并分離到MM上。滅活除用加熱方法外。還可用紫外線照射或藥物處理。

    總之，原生質體融合作為發展迅速的一項育種技術，具有*的*性，主要表現在以下幾個方面：①原生質體融合可以提高重組頻率；②用于原生質體融合的雙親可以少帶標記或不帶標記；③通過雙親或多親本的原生質體融合，使遺傳物質的交換、傳遞更完整，易形成穩定的二倍體；④原生質體融合沒有嚴格的受體與供體之分，是一種超越性障礙的育種方法，受接合型和致育型限制小，有利于不同種間、屬間微生物的雜交；⑤利用原生質體融合．實現多親融合．使各親本的整套染色體及核外遺傳物質集中到一體，有可能增加控制代謝產物產量的結構基因的拷貝數．從而提高目標產物產量。

    原生質體融合與誘變相結合，有可能實現增產和加速育種進度的目的。如把兩親株分別進行數次誘變處理，然而進行原生質體融合，使相互間遺傳物質進行充分交換，從中有可能篩選到由各次誘變累積的能有效提高目標產物產量的突變基因功能都能充分發揮出來的重組體。